T細胞耗竭是在慢性感染和癌癥的長期刺激下，T細胞喪失功能的狀態(tài)。其主要表現為：增殖能力降低，抑制性受體（Inhibitory receptors，IRs）持續(xù)高表達，以及效應細胞因子減少等特征，其轉錄和表觀遺傳進程均被改變。無法持久地逆轉CD8 T細胞衰竭仍然是治療癌癥和慢性感染的主要障礙。更好地了解誘導和維持衰竭的分子線索將有助于開發(fā)更有效的治療方法來預防或逆轉這種狀態(tài)。體內模型已經產生了關于Tex的基礎知識，但產生的細胞產量低，耗時，昂貴，難以規(guī)?；?。因此，這些系統(tǒng)對于高通量篩選方法來說并不理想。
美國賓夕法尼亞大學的E.John Wherry團隊多年來致力于T細胞耗竭相關研究，今日該團隊在Science Immunology雜志發(fā)表題為In vitro modeling of CD8+ T cell exhaustion enables CRISPR screening to reveal a role for BHLHE40的文章，他們通過體外慢性刺激，構建了CD8 T細胞耗竭的模型，并以體內Tex模型為基準，對該體外模型從分子表型，轉錄水平和表觀遺傳水平評估，證明其體現了多種體內Tex的特征，然后通過對體外模型的CRISPR高通量測序，篩選出轉錄因子BHLHE40調控T細胞耗竭進程。

研究人員將P14 CD8 T細胞（特異性識別LCMV D^bGP^33-41表位的TCR）與D^bGP^33-41刺激的C57BL/6小鼠脾樹突狀細胞(DC)共培養(yǎng)，在第0天使用D^bGP^33-41多肽刺激后，慢性刺激模型每兩天使用D^bGP^33-41和IL-2刺激，而急性模型僅加入IL-2。結果表明，慢性模型中細胞增殖受到抑制，且凋亡敏感性增加。雖然急性模型中IRs升高，但隨時間減弱，而慢性模型中IRs表達更高，且持續(xù)表達。而慢性模型中的多種效應因子也更低，但仍高于體內Tex。
隨后，研究人員針對體外耗竭模型進行測序，以探究其轉錄和表觀遺傳特征。RNA-seq結果顯示，在d4時，慢性模型和急性模型定位一致，差異基因僅有634個，而在d7時差異基因達到2844個，表明二者具有相似的起始進程，而是在d7時發(fā)生分化，其中急性刺激P14細胞偏向于Tmem表型，而急性模型中則偏向Tex表型?；蚋患治鲋校w內Tex上調的基因在慢性模型的P14細胞中傾向富集，這些基因與T細胞激活的負調控相關。在針對表觀遺傳特征的ATAC-seq檢測中，兩模型中的P14細胞在d4均與Tex共定位，可能是與相關染色質可及性的激活有關。與轉錄水平一致的是，二者均表現出相似的初始途徑，以及在d7出現分化。

在證明體外慢性刺激模型可以體現體內Tex的特征后，研究人員通過CRISPR篩選，希望可以找出調控Tex進程的相關轉錄因子。結果顯示，BHLHE40在慢性模型中高頻表達，并且在急性模型中并未出現，提示其可能與T細胞耗竭密切相關。研究人員通過shRNA敲低BHLHE40的方法，發(fā)現PD-1、Tim3等多種IRs下調，提示其可能促進IRs的表達。為測試BHLHE40在體內調節(jié)CD8 T細胞的功能，研究人員將BHLHE40 shRNA KD的P14細胞轉入急性和慢性感染的小鼠體內，發(fā)現慢性感染的小鼠中BHLHE40敲低細胞有更強的增殖優(yōu)勢，而在急性模型中并未表現。而且在d31時，BHLHE40敲低細胞中部分IRs表達降低。同時，流式檢測結果則表明，BHLHE40敲低促進了P14細胞從Tex中期細胞向Tex祖細胞的分化。


綜上所述，本研究建立了一種體外T細胞耗竭模型，可以在很大程度上還原體內T細胞耗竭的特征，雖然不能完全模擬體內T細胞耗竭狀態(tài)，但仍可用于高通量測序等研究，并因此發(fā)現轉錄調控因子BHLHE40在T細胞耗竭的進程中扮演重要的角色。

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